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一、前言
面部创伤（例如严重烧伤）或肿瘤切除术后耳鼻的重建可能具有挑战性，特别是当软骨框架受损时。然后，自体软骨移植物通常与皮瓣联合使用，例如鼻子的前额皮瓣或耳朵的脾气膜筋膜瓣。然而，软骨移植物的供体部位可能有限，并且总是存在一定量的供体部位发病率。1特别是，软骨结构（如耳朵或鼻翼）的重建仍然是一个挑战，因为它们复杂的三维形状和对软骨特征的高要求。2软骨结构的弹性特性不仅与临床结果相关，而且与更基础的研究有关。
从临床医生的角度来看，人们倾向于关注移植组织的大规模力学。为了确定这一点，通常执行粗机械测试。例如，由Britt等人测量耳软骨和组织工程软骨的拉伸性能。3通过将增量拉伸载荷施加到哑铃形的软骨切口上。罗伊等人提出了另一种方法4谁比较了安装在机械光谱仪中的3点弯曲装置中的天然，工程耳骨和肋软骨。压缩载荷实验通常由受限压缩或压痕组成。5，6拉伸或压缩测量都有其优点和局限性。7然而，它们都有一个关键的局限性，即上述方法仅提供总解剖学尺度上的信息。目前，许多研究小组正在探索不同面部组织的再生医学和组织工程的可能性。例如，组织工程耳软骨可能是克服组织移植问题的一种选择，例如供体部位的发病率。8从手术的角度来看，上述机械测试很重要，因为我们需要足够强度的材料，以便在覆盖肌肉和皮肤时保持形状。然而，为了设计用于（软骨）组织再生的适当支架，关于细胞外基质（ECM）水平的更详细的机械信息至关重要。
组织工程的关键是为再生细胞保持其表型并形成新组织创造适当的环境。ECM是组织形式和功能的基础。9耳软骨ECM由胶原束，弹性蛋白纤维和糖胺聚糖的复杂混合物组成，每种都对组织的机械性能具有特定的影响。越来越多的证据表明，细胞非常容易受到其环境的机械特性的影响。10，11因此，支架的刚度对细胞行为和命运有重要影响。12–14从而在结构作为一个整体的机械特性上。为了形成正确的组织，支架必须与受损组织的原始硬度紧密匹配。因此，关于微尺度ECM生物力学的特定空间信息对于临床成功至关重要;随着时间的推移，我们需要能够在细胞（微观）水平上监测组织工程结构的机械性能。再生软骨将随着新的ECM组件和结构的发展而发生机械变化，支架退化并被替换。因此，在原子力显微镜（AFM）和大机械测试之间，在微观尺度上对组织工程和移植结构的质量评估对于再生医学的未来临床实施至关重要。为了解决这个问题，我们测试了一种商用压痕器件（Piuma Nanoindenter;Optics11，荷兰阿姆斯特丹）能够在适当的微尺度上进行测量。该系统基于套圈顶悬臂探头12其在生命科学研究领域的应用已经在不同领域得到证明。13，14在这里，我们扩展了这一系列研究，以评估其使用反向组织工程模型监测耳软骨再生随时间变化的适用性。
软骨对机械力的响应受2种机制的影响：流体动力学和ECM结构本身的变化。5糖胺聚糖通过吸引水分和使渗透压积聚而形成ECM的重要组成部分。15弹性蛋白纤维的分布和机械功能是耳软骨所有的。16它们对耳朵特定机械性能的贡献使得在植入工程软骨时，它们已经充分形成至关重要。相反，去除这些成分中的任何一个都会定性地影响软骨。我们设计了一个耳软骨组织模型，以反向方式模拟支架随时间推移的发展。通过对这些组分中的任何一种进行特定的酶降解，我们创建了一个客观的研究模型，以测试压头是否能够在非破坏性物质中以适当的尺度准确测量ECM的各种结构组分之间的差异。随着人们的广泛关注和最近的进展，例如用于组织再生的3维生物打印机，从头到尾监测发育组织的机械质量的能力对于在临床上实施这些新型组织工程方法至关重要。
二、方法
（1）样品制备
耳软骨是在附近屠宰场从2至3岁的荷兰奶山羊单侧获得的。耳朵（n = 9）被运送到冰上的实验室，在那里±2厘米2从每个耳朵的基部取出大小大小的软骨样本。将样品进一步横向分成三个5mm高的部分，并用一层薄薄的氰基丙烯酸酯（超级）胶水固定在玻璃显微镜载玻片上。新鲜测量每个耳样品的横向平面，然后将相同的样品在37°C的磷酸盐缓冲盐水中孵育，以便在24和48小时测量。其他2个样品以类似的孵育方式进行，但分别加入1%的透明质酸酶或弹性蛋白酶溶液（均来自密苏里州圣路易斯的Sigma Aldrich）以除去糖胺聚糖或弹性蛋白。
（2）缩进设置
使用商用纳米压痕仪（Piuma;光学11）。该仪器能够通过压痕局部测定样品在空气和液体环境中的机械性能。它采用套圈顶悬臂探头8，22施加负载，同时使用基于光纤的读数测量压痕深度。由此产生的应力-应变曲线（图.（图1A）1A）使用Oliver和Pharr描述的模型进行分析17，23用于球形压头，以确定有效的杨氏模量 （E*）。使用合适的探头进行设置，能够施加0.1至7.5 μN的力。在每个系列实验之前，通过缩进刚性表面并将悬臂弯曲等同于探头位移来执行悬臂弯曲校准。在许多方面，这种设置可与AFM相媲美。然而，与大多数通常在亚细胞（纳米）范围内起作用的AFM相反，这种设置也能够在细胞和组织范围内发挥作用。
A、软骨测量的压痕曲线。切线（红色）表示用于确定有效杨氏模量的卸载曲线的斜率。B，压头的图形细节：球形成压头（ø = 78μm）。
（3）压痕探头
使用直径为78μm，刚度为80 N /m的球形压头来接触面积，并将压痕过程中的组织损伤降至（图.（图1B）。1B）.为了进一步增加与的接触面积，通过使用设置的全压痕深度（20μm）使压痕深度。
（4）缩进协议
压痕协议经过精心优化，以最大限度地减少影响测量的粘弹性效应。使用2秒加载周期，2秒保持期和4秒卸载周期，可以精确确定曲线角系数。
（5）压痕实验
在实验过程中将样品浸没在磷酸盐缓冲盐水中，以防止脱水并最大限度地减少压头和组织表面之间的粘合力。在准备实验（未显示数据）中，没有发现胶水对负载的不利影响。每个样品都沿着软骨的中心线缩进，以避免边缘效应。为了平均手术切口和组织不均匀性可能的表面粗糙度效应，将每个样品缩进在相距300μm的9个位置以获得平均数据。
（6）组织学
将三个样品固定在4%福尔马林中，并嵌入石蜡中，根据标准方案进行切片。载玻片用Alcian蓝色或Lawson染色分别描绘糖胺聚糖或弹性蛋白纤维，并拍摄显微图像（徕卡DM4000B / DC500;韦茨拉尔， 德国;放大倍率，200×）。
（7）统计分析
在降解实验之前，通过对3个不同耳软骨样品的单一位置进行10次连续测量的类内相关系数（双向随机效应）来确定压痕的再现性。使用类间相关系数（ICC）计算降解实验中单个样品上单独压痕之间的变异性。基于这些结果，通过方差检验的单变量分析确定了有效杨氏模量的差异。所有分析均使用SPSS统计软件版本22进行。P值小于0.05被认为是显著的。
三、结果
这些实验的一个重要方面是压痕协议的定义，以确保粘弹性效应既不影响也不影响卸载曲线。粘弹性效应表现为压痕过程中能量的时间依赖性耗散。18这在应力-应变曲线中通过加载曲线和卸载曲线之间的面积进行可视化。奥利弗和法尔描述的模型17利用卸载曲线的斜率来确定有效的杨氏模量（图.（图 1A）。1为了实现这一点，在加载后引入保持期，以使样品有足够的时间在卸载样品之前使能量消散。除此之外，卸载速度保持足够慢，以使样品能够重新调整到不断减小的负载，因为延迟样品响应的累积会对卸载曲线产生不利影响。准备实验（数据未显示）表明，2秒负载，2秒保持和4秒卸载周期足以防止粘弹性效应显着影响卸载曲线（负载值线性下降，从而可以精确确定曲线角度系数;图）。图1A）。1A）.虽然样品在压痕深度方面在保持期后仍表现出松弛，但较长的保持期并不表明在*压痕期间能量耗散的显着变化。探针直径的选择基于组织学切片，显示平均山羊耳状软骨细胞直径约为10μm，而含有2或3个软骨细胞的更椭圆形的腔隙最长测量在40μm左右（图。（图 2）。2).因此，78μm被认为足以测量平均ECM值，同时仍然足够精细以提供详细信息。文献中的力学测试显示，耳软骨的杨氏模量范围为0.8至8 MPa。16以此为参考，选择了刚度为80 N / m的悬臂，以确保探头的大部分行程将转化为压痕深度而不是悬臂弯曲，从而产生7至15μm之间的压痕深度。
山羊耳朵软骨横截面的微观明场滤波图像（100×）。平均空隙大小约为40μm（红色椭圆）。
通过在3个不同样品上的单个点重复压痕来确认压痕系统的可重复性，ICC为0.99。组织学证实了糖胺聚糖和弹性蛋白从进行压痕实验的外围区域的处理组织样品中降解（图。（图3）3).
3 个随机标本（山羊 1、4 和 7）的组织学图像 （200×）在 48 小时处染色糖胺聚糖（阿尔西安蓝染色，左部分）和弹性蛋白（劳森染色，右部分）。所有图像均从横向样品侧拍摄，其中进行压痕（每张图像的顶部），并且最大限度地暴露于酶。两组对照样品均显示强糖胺聚糖或弹性蛋白染色。用透明质酸酶或弹性蛋白酶处理的样品显示出污渍强度降低，特别是在虚线框所描绘的横向（缩进）区域。酶渗透和随后的降解都绰绰有余，远远超过最大压痕测量深度（>20μm）。
每个样品的不同测量结果具有良好的再现性，ICC平均值为0.9（0.81-0.98）。发现耳软骨有效杨氏模量的本地值为5.2 MPa（±0.7）。透明质酸酶治疗24和48小时后，这些值分别降至2.2 MPa（±0.6）和2.0 MPa（±0.3）。特别是在弹性蛋白酶组中，个体差异差异很大，24小时时平均有效杨氏模量为4.2 MPa（±0.62），48小时后平均有效杨氏模量为3.0 MPa（±0.44）（图。（图 4）。4).对照组的加班时间也略有下降，可能是由于自溶过程，但48小时后所有治疗组之间均观察到稳定且显着的差异（P <0.001）（图5）5).
Young在24小时（左）和48小时（右）下每组不同样品的模量。Co，控制;Ela，弹性蛋白酶处理组;Hya，透明质酸酶治疗组。
24小时和48小时降解后样品组的平均杨氏模量（**P <0.001）。对照组在24小时后显示初始僵硬丧失，但在48小时时没有进一步下降。弹性蛋白酶处理组（Ela）与透明质酸酶处理组（Hya）不同，在酶暴露24小时后没有显示出明显的僵硬损失。在48小时时，与对照组相比，所有治疗组的僵硬均显著降低。
四、讨论
当临床医生想到组织工程时，他们往往倾向于只关注总机械性能的最终结果，因为从临床角度来看，这一方面对手术成功至关重要。然而，现在人们越来越认识到，许多组织工程植入物由于细胞的异常行为导致钙化或变形和再吸收而长期失败。19优化细胞将遇到的生物力学环境可能是指导细胞分化和基质生产质量的关键。测量Young组织和支架模量的细微差异的能力对于正确微调细胞生物力学微环境至关重要。在这项研究中，我们研究了一种能够在细胞水平上测量组织硬度的新工具，该工具不仅可以对发育组织和构建体的最终特征进行无损评估，还可以对发育中的组织和构建体的起始条件和过程质量进行无损评估，从而促进新型，有效的组织工程方法的开发。
我们选择了“反向组织工程模型"，使用山羊耳朵软骨作为新鲜材料的一致来源，以证明这项新技术在测量各种组合物中的组织弹性的适用性。为了探索我们的设置的适用性和灵敏度，以检测组织（再）生成过程中组织（再）生成过程中ECM质量和组成的细微差异，以组织刚度为结果参数，我们用不同的降解酶处理成熟的弹性软骨。弹性蛋白或糖胺聚糖的去除导致弹性的显着普遍降低。然而，弹性蛋白酶消化组的巨大差异令人惊讶。史密斯等人20已经注意到，它们在椎间盘环纤维中酶促降解弹性纤维的广泛方案不是绝对的。特别是在弹性蛋白酶组中，他们报告了高变异性。他们进一步提出，弹性纤维的降解会导致胶原结构的分离和变形。这可以解释为什么我们在弹性蛋白酶组中发现了如此大的品种;换句话说，这可能是由于弹性蛋白浓度的变化和随后动物之间的降解以及剩余胶原基质的重排。后者也可以解释一些样品的弹性最初略有增加。在一项关于弹性蛋白酶对猪肉色动脉壁的影响的研究中也观察到了这种效应。21弹性蛋白酶降解与动脉壁肿大有关，但与硬化或软化无关。弹性蛋白纤维改变后ECM的结构变化也被提出是耳朵随着年龄增长而增大的原因。22
总之，确定（亚）细胞水平上的机械性质对于深入了解细胞外力学的优化至关重要。我们使用的光机械传感器系统提供了一种快速可靠的方法来测量该水平上的软骨ECM变化。目前，我们正在探索将压痕系统与光学相干断层扫描相结合的可能性，这将允许在缩进时同时可视化组织结构。因此，可以以无创方式辨别不同组织层的硬度。将来，这可能为我们提供一种重要的临床工具，以确定面部重建中移植或再生组织的质量。
