Piuma生物纳米压痕仪在人耳、鼻翼和鼻中隔软骨的结构和机械比较

一、介绍

         软骨在面部特征的形式和功能方面起着关键作用。当鼻子或耳朵的软骨因损伤而受损时，它没有再生的能力。这意味着一旦耳朵或鼻子的软骨结构被破坏，耳朵或鼻子就会残缺不全。然后，需要一个重建程序来创建一个具有能够承受正常机械力的良好3D结构的新框架。实际上，鼻窦或轻微耳缺损的重建常使用耳廓或鼻室间隔软骨移植物进行。1，2在更广泛的情况下，可以使用肋软骨，为收获提供更多的材料并提供更刚性的支撑。耳、室间隔或肋软骨可用于重建，但移植材料的可用性通常有限，供体部位的发病率仍然是一个风险。烧伤患者尤其如此，由于突出的位置和薄薄的皮肤覆盖，他们经常遭受鼻子和耳朵的广泛损伤。1，3，4因此，再生医学为克服这些问题提供了令人兴奋的可能性。组织工程领域的新发展已经进入临床。例如，Yanaga等人进行了几项临床实验，其中从耳朵分离的自体软骨细胞中新开发的软骨用于耳朵框架重建。2，5随着对组织工程替代品的日益关注，我们需要有关我们正在寻求复制的组织的结构信息。然而，文献中关于各种面部软骨类型（特别是耳，鼻翼和鼻间隔软骨）之间的机械特性以及组成和结构差异的数据很少。

    虽然它们具有共同的胚胎起源，但面部软骨很快就会根据其特定的结构功能分化成不同的软骨亚型。在脊椎动物发育的早期阶段，将成为头部和颈部的胚胎区域被短暂地划分为称为咽弧（PA）的片段。耳朵具有组合的起源，来自PA1和PA2，它们在6周发育时形成他的小山丘。最终，这6个小山丘融合在一起形成外耳。6，7PA1进一步向外生长，形成下颌骨突和上颌骨突。后者后来形成额叶突出以及内侧和外侧鼻突，其将形成鼻翼，并在最终融合到鼻中隔后形成。8

    成熟的耳软骨由弹性蛋白纤维和胶原束的复杂网络组成，这些胶原束被一层周旋物包围。这种高弹性蛋白含量使其在面部区域的各种软骨亚型中。另一方面，人类鼻子的解剖结构由几个独立的结构元素组成。主要部分是鼻中隔，为鼻梁以及鼻外侧和小叶软骨的两侧提供支撑，以支持鼻窦。该侧区域还包括几个芝麻软骨和附属软骨。与耳软骨相比，鼻部结构全部由透明软骨组成。透明软骨主要由胶原蛋白组成，特别是II型，分为几个区域。9

    细胞外基质（ECM）结构及其生化组成对软骨的机械功能至关重要。标准生化测定可用于测定主要组织组分的浓度。为了可视化ECM的3D结构，多光子激光扫描显微镜已被用于其他组织，如关节软骨。10该方法能够揭示必需的基质成分，即软骨细胞，胶原蛋白和弹性蛋白纤维，无标记，具有亚细胞分辨率和深度渗透。11

    据报道，面部软骨类型的僵硬差异很大。由于使用不同的技术来测量软骨，因此很难给出一般值。除了具有不同局限性和优点的拉伸或压痕测量外，12辨别机械测试的不同幅度或规模也很重要。对于大机械性状的评估，对于维持大形状很重要，特别是在手术重建中，已经描述了各种技术。13–16这同样适用于原子力显微镜（AFM），其中对软骨的表面微观力学进行了广泛的研究。17–19然而，在AFM和粗大机械测试之间，支架细胞环境的机械条件对细胞的行为有重要影响。20因此，它是软骨充分再生的基础。21因此，需要深入了解ECM水平上的局部机械性能和结构，以便为细胞分化提供合适的环境。本研究中使用的设备允许在更高深度范围内以微米级压痕，提供有关不同软骨亚型的基本机械信息。

     了解组织结构的基础知识对于充分的组织工程至关重要。从实践中，外科医生熟悉了重建手术中软骨的粗机械特征。然而，机械行为基本上是通过细胞及其周围结构的复杂共生在微观尺度上确定的。

     在本文中，我们的目标是通过使用新技术在ECM水平上评估这些参数，在结构和机械水平上提供有关面部软骨类型之间差异的基本信息。虽然没有直接的实际意义，但它也可以为外科医生提供新的见解和灵感，通过更好地了解他们所处理的组织的性质来优化他们的重建工作。随着再生医学的进步，外科医生将达到一个点，这些知识将被证明是无价的。

二、方法

    （1）样品

     根据该机构的道德准则，从10名新鲜冷冻尸体供体（8名男性，2名女性）中收集软骨样本，平均年龄为66.5±6年。从每个供体中，用4mm活检打孔器从耳壳，内侧鼻丝软骨和外侧鼻翼软骨中取出2个相邻样本。样品在-20°C下运往VU大学（荷兰阿姆斯特丹）进行生物力学和微观评估，或EMC（荷兰鹿特丹）进行生化评估。在实验前解冻样品，并通过手术切除剩余的组织和周边。

    （2）凹痕

         为了确定机械性能，使用新型商用纳米压痕仪（Piuma;Optics11，荷兰阿姆斯特丹）。该设备采用套圈顶悬臂探头22施加负载并使用基于光纤的读数同时测量压痕深度（图1.（图1A，1A， C）。在此设置中，使用了直径为78 μm的球形探头，能够在压痕深度为1至17 μm时施加0.1 μN至7.5 mN的力。在每个系列实验之前，通过缩进刚性表面并将悬臂弯曲等同于探头位移来执行悬臂弯曲校准。每个样品在同一解剖位置上以网格模式缩进10次，测量之间的距离为100μm。由此产生的应力应变曲线（图.（图1B）1B）使用Oliver和Pharr推导的球形压头的数学模型进行分析，以确定有效的杨氏模量（E *）。23压痕协议经过精心优化，以最大限度地减少影响测量的粘弹性效应（未显示数据）。

图 1.

压痕和多光子激光显微镜技术概述。A，悬臂压痕装置的设置（Piuma，Optics11）。B、软骨测量的压痕曲线示例。红色切线表示用于确定杨氏效应模量的卸载曲线的斜率。C，压头的图形细节，球形成压头的（φ78μm）。D，光学设置多光子激光扫描显微镜TriMScope I（LaVision Biotech），钛蓝宝石激光器。E，SHG通道显示胶原蛋白束。F，2PF通道显示弹性蛋白纤维。BP，带通滤波器;CIT，悬臂压痕;DM，二向色镜;GS， X-Y 振镜扫描镜;红外-L， 红外激光;红外-PD，红外激光二极管;L，透镜在PMT的前部;MO，显微镜物镜;OF， 光纤;聚酰胺，光电倍增管;SL，扫描镜头;TL，镜筒透镜。

   （3）生化评价

        在生化分析之前，测定所有软骨样品的湿重，然后在60°C下在木瓜蛋白酶溶液（0.2M Na）中消化过夜2H2采购订单4， 0.01M 乙二胺四乙酸乙酯2O，250μg/ mL木瓜蛋白酶，5mM L-半胱氨酸，pH 6.0）。

    每个木瓜蛋白酶消化的软骨样本中测量的DNA量由溴化乙锭（GibcoBR1）测定，使用小牛胸腺DNA（Sigma-Aldrich）作为标准。用分光荧光计（Wallac 1420 Victor 2;Perkin-Elmer，韦尔斯利，马萨诸塞州），使用消光滤光片（340 nm）和发射滤光片（590 nm）。

    进行1，9-二甲基亚甲基蓝（DMMB;pH 3.0）测定以测量每个木瓜蛋白酶消化软骨样品中的硫酸糖胺聚糖（GAG）含量。使用VersaMax分光光度计在530和590nm处监测DMMB的异色反应。以鲨鱼硫酸软骨素C为标准。根据制造商的说明，使用总胶原蛋白测定法（荷兰莱顿的QuickZyme Biosciences）测量羟脯氨酸含量以估计胶原蛋白数量。简而言之，将木瓜蛋白酶消化物在95°C下用等体积的12M HCl水解18-20小时。使用Prockop和Udenfriend方法（Prockop和Udenfriend，1960）的修饰测量羟脯氨酸含量，并归一化为样品湿质量。

     根据制造商的说明，使用Fastin弹性蛋白测定（Biocolor，Carrickfergus，UK）测量软骨样品的弹性蛋白含量。简而言之，软骨样品在加入试剂盒的染料之前，在100°C下在0.25M草酸中通过3个过夜热提取循环转化为水溶性α弹性蛋白。在VersaMax板读数器上在513nm处测量吸收。来自牛颈韧带的α弹性蛋白（由制造商提供）被用作标准。

    （4）多光子显微镜

     软骨的结构信息是通过多光子激光扫描显微镜获得的，使用来自未处理的软骨的固有光信号。成像设置包括商用2光子激光扫描显微镜（2PLSM，TriMScope I;Lavision BioTec GmbH）和飞秒激光源（图2（图1D）。1激光源为飞秒Ti蓝宝石激光器（相干变色龙Ultra II），在800 nm处产生约200 fs脉冲，线性偏振，重复频率为80 MHz。激光束通过25×1.N.A.水浸物镜（尼康APO LWD）聚焦在软骨样品上，横向分辨率约为0.5μm，轴向分辨率为约2μm。将样品上的激光功率调节在5-50 mW范围内，以获得足够的信噪比并避免组织光损伤。激光束通过一对振镜横向扫描在样品上。深度扫描是通过用步进电机移动物镜来完成的。

     二次谐波（SHG）和2光子荧光（2PF）光子由胶原（SHG，2PF）和弹性蛋白（2PF）纤维以及细胞内自发荧光蛋白产生，并在表观几何中收集。SHG和2PF光子通过二向色镜（色度T695lpxrxt）从800nm激发光子中过滤，然后通过二向色镜（色度425lp）分成SHG和2PF通道，通过SHG（色度Z400 / 10X）和2PF（色度HQ500 / 140M-2P）的干涉滤光片，并通过高灵敏度GaAsP光电倍增管（Hamamatsu H7422-40）检测（图。（图1E，1E， F）。

     使用TriMScope I软件（“Imspector Pro”）进行数据采集，并以16位tiff格式存储图像堆栈，并使用“ImageJ”软件（MacBioPhotonics）进一步处理和分析。

     （5）统计分析

     使用具有Bonferroni校正的混合模型分析生化差异。组间有效杨氏模量的差异是通过广义估计方程确定的。为了测量刚度与生化含量之间的相关性，使用了二元相关性模型。所有分析均使用SPSS统计软件版本22进行。P值小于0.05被认为是显著的。

三、结果

（1）凹痕

    压痕显示耳软骨（1.14±0.71 MPa）和鼻间隔软骨（2.65±1.78 MPa）和鼻窦软骨（1.26±0.51 MPa）和鼻间隔软骨（P = 0.005）之间的硬度差异（P = 0.011）（图。（图 2）。2).然而，阿拉鼻与耳软骨的比较显示没有显着差异。每个软骨类型的硬度在供体之间差异很大（参见图，补充数字内容1，其中显示每个软骨类型的供体之间的硬度差异很大。

图 2.

压痕显示耳软骨和鼻间隔软骨之间的硬度差异显着（*P = 0.011）以及鼻窦软骨和鼻间隔软骨之间的硬度差异（**P = 0.005）。鼻疙瘩和耳软骨之间未见显著差异。

    （2）生物化学

     鼻软骨（2.35±1.20 μg/mg干重）中基于DNA含量的细胞密度显著高于耳朵软骨（1.13±0.23 μg/mg干重）或鼻中隔（0.94±0.52 μg/mg干重）（P = 0.005和P = 0.001）（图。（图 3A）。3耳软骨（141.40±27.2μg/mg干重）的弹性蛋白含量明显高于鼻窦蛋白（60.12±18.35μg/mg干重）和隔膜（17.38±16.71μg/mg干重）（图.（图 3B）。3B）.软骨类型间水和胶原蛋白含量无显著差异（图.（图3C）。3在鼻子中，鼻中隔（96.00±23.21μg/mg干重）的GAG含量似乎略高于鼻腔（64.61±30.42μg/mg干重）（图。（图3）3D).

图 3.

生化分析结果显示软骨类型之间的组成存在明显差异。虽然鼻腔软骨和鼻中隔在组织结构上具有很强的相似性，但它们在DNA和GAG含量方面存在显着差异（P分别为0.001和P = 0.024）。鼻软骨含有非常有限的弹性蛋白。这可能部分归因于结缔组织残留物，尽管已谨慎地尽可能多地去除这些结缔组织残留物。

根据软骨亚型，有效的杨氏模量与细胞密度，GAG或胶原蛋白含量没有显着相关性。然而，在室间隔软骨中，弹性蛋白含量低与硬度较高有关（表（表11).

表 1.

二元相关性模型，显示每个软骨亚型的生化组成与刚度（有效杨氏模量）之间的相关性

   （3）多光子显微镜

     在矢状面的中段对2个供体的软骨样本进行成像。生成的SHG和2PF显微镜显示耳软骨和鼻源软骨之间存在显着差异（图。（图 4）。4).不仅弹性蛋白纤维（绿色）的缺失明显，鼻软骨的一般结构也与耳朵不同。与耳软骨的致密纤维网络相比，来自鼻腔区域的软骨提供更弥漫的图像。软骨是软骨细胞在其细胞周围基质内的团聚物，在两个供体中都比鼻窦中隔大。

图 4.

从上到下：供体样本3和5。从左到右：阿拉纳西，隔膜，耳朵。绿色：弹性蛋白;红色：胶原蛋白。与鼻软骨样本中的弥漫性绿色背景信号相比，耳软骨中的纤维结构清晰可辨。如图所示图 3，3，DNA含量变化很大，这在隔膜图像的不同细胞密度中也可以辨别出来。

四、讨论

  据我们所知，这是第一项比较人类供体中所有3种面部软骨类型之间的生化，3D结构和机械差异的研究。通过在ECM水平上测量软骨组成，结构和刚度的差异，我们旨在确定足够的组织工程所必需的面部软骨结构的重要方面。

    这与软骨的组织工程有关，软骨在过去十年中受到了广泛的关注。已经提出了各种不同的细胞类型和支架，用于耳骨或鼻软骨工程。24–29虽然已经获得了有希望的结果，但大多数再生组织通常只是原始组织的非常边缘的替换。这项研究表明，在ECM尺度上，软骨类型之间存在显着差异，即使它们在机械性能上相似。

    已知耳软骨的组成与鼻间隔软骨不同，因为它含有弹性纤维。29我们可以通过生化分析测量鼻软骨中少量的弹性蛋白。这与新西兰白兔的一项研究一致，该研究使用免疫组织化学染色，在耳软骨基质中特异性地发现了高弹性蛋白含量，而在鼻间隔细胞周围区域仅发现了中等弹性蛋白含量。30基质包含相当一部分弹性蛋白的事实表明，这可能为耳软骨的机械质量提供重要的归因。3

    耳窝软骨和鼻腔软骨的有效杨氏模量显著低于鼻中隔软骨。然而，耳朵和鼻软骨之间的僵硬在统计学上没有差异，尽管弹性蛋白含量有明显差异。这些发现与Griffin等人的观察结果相符。32谁发现鼻窦和鼻间隔软骨之间的硬度差异相似。

     在最近的一篇文章中，Nimeskern等人。33探索弹性蛋白如何影响软骨的机械行为。他们发现牛透明关节软骨和耳软骨的粘弹性行为不同，耳软骨更具弹性，而关节软骨对瞬时负荷表现出更高的抵抗力。在酶处理以去除弹性蛋白和/或GAG时，他们证明耳软骨的压缩机械性能似乎主要是由于弹性蛋白纤维网络，而这些性能是由关节软骨中的胶原蛋白提供的。此外，GAG对软骨类型之间机械行为的影响似乎不同：在耳软骨中，GAG对力学没有重大影响，而在关节软骨中，GAG具有明显的影响。虽然组织不同，但在真皮瘢痕组织中也注意到弹性蛋白的预期作用与实际机械性能之间的这种明显差异。34这证明了组织组成在组织的机械功能中的复杂作用。

     软骨类型之间机械行为的差异不仅可以通过其生化成分确定，还可以通过组织结构来确定。使用多光子激光扫描显微镜，可以详细描绘不同软骨类型的3D结构。有趣的是，尽管鼻窦肠炎在外观上与鼻间隔软骨非常相似，弹性蛋白含量也很低，但其机械行为与耳软骨更相似。（参见视频，补充数字内容2，它在3D堆叠图像视频中显示ala nasi软骨结构的多光子激光扫描显微镜， 并查看视频，补充数字内容3，它在3D堆叠图像视频中显示隔膜软骨结构的多光子激光扫描

     虽然在一般外观上相似，但我们观察到软骨大小似乎在鼻中隔软骨和隔膜软骨之间有所不同。然而，样本量很小，没有收集到任何统计证据来支持这一方面的发现。

     供体变异性很大，并且很难将我们的数据与文献进行一般比较，因为以前没有进行过在机械，结构和生化方面比较这3种软骨类型的研究。我们的数据与Nimeskern等人的观察结果相符。29隔膜软骨比耳软骨更硬，含有更高的GAG，但DNA较低，表明细胞浓度较低。我们的发现也与Griffin等人进行的一项研究的结果相匹配。32与鼻中隔相比，测量鼻窦软骨硬度较低的人。对于组织工程目的，进行压痕实验的尺度为细胞水平上适当的支架刚度提供了很好的参考。SHG被证明是在3D中无创地描绘胶原蛋白和弹性蛋白束结构的好工具（参见视频，补充数字内容4，它在3D堆叠图像视频中显示耳朵软骨结构的多光子激光扫描显微镜。这些信息可以转化为3D打印支架的结构模板，并与力学和生化内容数据一起为面部软骨重建的支架优化提供了新的一步。

     我们使用高龄捐赠者的软骨样本（平均66.5±6岁）。年轻患者的机械行为和组织学可能因衰老过程中的钙化和结构变化而有所不同。例如，耳朵在一生中体积持续扩大，这归因于衰老过程中弹性纤维的变化。35然而，对于隔膜，Richmon等人。16发现年龄和性别之间的机械性能没有显着差异。虽然样本来自所有供体的同一解剖位置，但可能发生了微小的变化。这是一个限制，因为一些研究表明，在单独的软骨类型中，含量存在区域差异。32尽管面部软骨的定位和作为软组织支持的可比作用表明相似的特征，但面部软骨实际上与另一个软骨*不同。软骨组织的特定功能，例如，关节软骨的压迫和耳软骨的柔韧性，可能需要不同的机械测试方案。我们选择微压痕来探索ECM的刚度;关于我们的发现，也许有必要结合机械测试才能引发各种软骨成分的不同结构作用。在未来，包括宏观力学测试可能会很有趣，因为大机械性状也受到其他因素的影响，如围铤和解剖学形式。15，36

     从外科手术的角度来看，有趣的是，组织组成和机械行为并不总是像预期的那样相关。我们没有找到阿拉鼻软骨硬度较低的解释。它确实支持这样一种概念，即来自不同来源的组织移植可以作为重建手术中的结构替代物。使用贝壳组织进行阿拉鼻重建就是一个很好的例子。本文未涉及但需要考虑的其他领域是细胞相互作用，包括蛋白质组学和代谢，因为细胞存活和行为是组织工程和长期成功移植的关键。面部软骨类型不仅在结构上不同，而且在细胞含量上也有所不同，这一发现可能对手术重建有影响，因为具有较高细胞浓度的组织在移植时可能需要更丰富的营养环境。在我们看来，实践经验和基础研究知识的融合将证明在一个组织工程迅速成为现实的世界中至关重要，这是外科医生不容忽视的发展。

    了解组织的完整组成，结构，机械和生化，对于再生适当的支架环境以进行面部软骨再生至关重要。这尤其反映在一个发现中，尽管其3D结构与鼻中隔软骨相似，但鼻窦具有与耳软骨更相似的基质硬度。有鉴于此，弹性蛋白的作用仍有待进一步引出，也许我们应该质疑它的名字在它对组织力学的贡献方面是否没有误导性。