细胞机械牵张拉伸应力加载系统在心血管细胞中的应用

　更新时间：2023-03-07　点击量：734

一、背景

机械负荷是工程心血管组织中组织特性的强大调节剂。为了最终调节生化过程，必须量化机械负荷对工程心血管结构特性的影响。，涂有聚-4-羟基丁酸酯（P4HB）的多孔聚乙醇酸（PGA）支架部分嵌入有机硅层中，以允许心血管工程结构的长期单轴循环机械应变。与未应变构建体相比，这些构建体承受了两种不同的应变量级，并且在生化性能、力学性能和微观结构组织方面表现出差异。结果表明，当组织暴露于长时间的机械刺激时，会诱导具有较高交联比例的胶原蛋白的产生。然而，以大应变大小的应变对组织的机械性能产生负面影响。此外，与构建体的深层相比，动态应变诱导了表层中细胞和胶原蛋白的不同排列。所提出的模型系统可用于系统地优化工程心血管组织的培养方案。

机械调节对细胞生物合成活性的影响已经在二维和三维培养条件下进行了研究，并且这种效果取决于ECM的性质。通过使用各种培养系统（例如纵向拉伸装置和真空驱动装置）刺激细胞。已经进行了几项研究，着眼于机械刺激对复杂几何形状的组织重塑的影响。在定义明确的简单几何中进行了类似的实验。塞利克塔等培养的。成纤维细胞填充的胶原凝胶（管状构建体）在存在下精确控制变形。只有有限数量的研究集中在明确定义的机械负荷对工程心血管组织特性的影响，其中研究了ECM的从头形成（例如，用细胞接种的聚乙醇酸（PGA）支架）。需要对工程结构中的组织特性进行机械控制。这需要详细研究明确定义的加载条件对ECM合成和ECM组织的影响，以优化加载方案。

二、材料和方法

细胞和组织培养

人隐静脉细胞（HSVC，肌成纤维细胞）取自一名44岁的女性，并使用常规细胞培养方法生长。44细胞在由*Dulbecco改良鹰培养基补充有10%胎牛血，1%l-谷氨酰胺和0.1%庆大霉素。

将支架真空干燥48小时，然后暴露于紫外线下1小时，随后置于70%乙醇中4-5小时以获得无菌。让支架干燥过夜，然后用磷酸盐缓冲盐水。在细胞接种之前，将组织培养基加入支架中16小时以促进细胞附着。使用纤维蛋白凝胶作为细胞载体，将第7代的HSVC细胞接种在这些支架上。细胞以每厘米约20万个细胞的浓度接种随后将组织构建体在组织培养基中培养（在37°C和5%CO2).组织培养基每3-4天更换一次，由补充有10%FBS，1%l-谷氨酰胺，0.3%庆大霉素和l-抗坏血酸2-磷酸。

应变拉伸

将工程心血管构建体培养3周，包括6天无施加负荷以使细胞在接种后适应，然后以2 Hz的频率进行1周的动态应变。应用三种不同的应变条件：0%应变，4%动态应变和8%动态应变（n = 8）。在以4%和8%应变的单独样品上进行所施加应变的测量2周和3周（n = 6）。

机械测试

培养3周后牺牲构建体，并在1小时内测试其机械性能（n = 6）。从样品中除去有机硅层，并将剩余的组织置于组织培养基中以滋润样品。样品的厚度和宽度使用以下命令测定 Plμ 2300 非接触式光学图像轮廓仪。代表面积为 8.35 × 7.85 mm2使用5×物镜以1×的扫描速度进行扫描。通过对代表性区域求平均值来获得厚度和宽度。

组织形成的生化测定

三、结果

循环应变对组织性质的影响

表征不同应变大小对工程心血管组织特性、构建体的切线刚度以及 DNA、GAG、胶原蛋白和 HP 交联量的影响（表1）被量化。相对于未应变的工程组织构建体，循环菌株不会增加工程组织构建体中每干重的DNA量。然而，与未过滤的组织结构相比，机械应变结构体中每 DNA 的胶原蛋白和每 DNA 的 GAG 显着降低。另一方面，在两种应变条件下，每个三螺旋的HP交联数量显着增加。4%应变结构的切线刚度等于未应变组织结构的刚度，而8%应变结构相对于未应变结构和4%应变结构的刚度均显着降低（图）。4).

3周龄工程心血管结构的切线刚度（MPa）作为不同应变大小的函数。*表示与参考条件 0% （*p < 0.05）的显著差异，表示与 4% 加载条件（p < 0.05）的显著差异++

四、讨论

机械负荷是活组织内生化过程的重要调节器。为了调节这些生化过程，必须量化机械负荷对工程心血管结构特性的影响。在这项研究中，提出了一个实验框架，其中使用应变系统的改编版本在一次实验中同时对单个样品施加各种应变量级。系统可实现高通量的样品，并且易于长时间保持无菌状态。多孔PGA / P4HB支架部分嵌入有机硅层中，允许这些结构的重复和单轴长期机械应变。这些构建物附着在Bioflex孔（美国Flexcell Int. Corp.）上，经受两种不同的应变量级数周，与未应变的构建物相比，在生化性能、机械性能和微观结构组织方面显示出差异。结果表明，长时间的机械刺激诱导具有较高交联分数的胶原蛋白的产生，从而改善了胶原蛋白的内在机械性能。然而，过大的应变导致应变对组织的机械性能产生不利影响。此外，与构建体的深层相比，应变诱导了表层中细胞和胶原蛋白的不同排列。

为了能够拉伸三维工程心血管结构，模型系统得到了进一步发展。组织结构的组成部分之一是涂有P4HB的PGA，以前没有表现出弹性材料行为。因此，部分多孔PGA支架嵌入在一层薄薄的液态硅胶中。这允许对这些工程组织进行动态拉伸。在培养2周（1周菌株）后验证应变场，支撑有机硅层的存在导致工程结构的弹性响应，这可以通过在培养2周后保留最初施加的应变的事实来说明。然而，3周后的应变分布无法确定为结构与支撑有机硅层部分分离，这大约对应于PGA机械完整性的损失。虽然应变没有确定，但动态成分仍然存在。这意味着受控应变最终可以在 2.5-3 周的时间内应用。对不同应变场的分析表明，平均应变构成了所施加的应变，对无组织构建的膜进行了验证。然而，组织结构的应变分布更加不均匀。可能，不均匀的变形可以归因于由不均匀的组织形成引起的不均匀的组织特性。设置的限制是组织形成（图。5A-C）由于有机硅层存在下营养物质供应减少而收缩到结构表面。

在本研究中，动态应变对增殖没有影响。动态菌株和未菌株构建体之间每干重的DNA量没有差异。以前，在相对长期的研究中，细胞增殖不受机械负荷的影响。2，28，38 然而，Mol等人。38确实显示出自由浮动工程心血管结构的增殖水平升高，这些结构不受机械约束。必须认识到，在这项研究中，未应变的结构并非没有压力。HSVC属于肌成纤维细胞表型25，38，这些肌成纤维细胞产生连续的等长张力。24 由于工程结构被支撑硅胶层限制为收缩，因此在结构中产生了内部张力。（肌）成纤维细胞收缩产生的内部应力足以限制细胞增殖。

背景当前细胞基础研究以二维静态培养为主，这种平面培养与实际“动态+立体"模式差别很大，导致细胞形态学、细胞分化、细胞间相互作用与体内动态环境产生明显差异。比如细胞骨架重组、细胞形态以及基因蛋白表达改变等。

细胞牵张系统将带来跨领域的创新：

· 动物实验前更可靠的评估

· 干细胞分化机制

· 机械刺激力与癌症的相关性

· 生医材料与细胞动态特性研究

· 体外疾病微环境的快速建立

体内活细胞存在于动态的生理环境中，受到广泛的机械刺激。包括拉伸、压缩、剪切应力和流体静压力等技术背景研究表明，细胞机械感受器检测这些刺激的作用并将信号传递到内部，进而对细胞活动产生影响然而在一般的体外培养和分析条件下，细胞没有受到来自生长环境的力学刺激。机械刺激培养系统通过机械力刺激，提供与体内细胞相似的生理环境

细胞牵张培养细胞在机械牵张应力刺激下，形态和生物学功能会产生相应变化。具体方法为将细胞悬液接种在一个具有弹性膜结构的培养皿中，在细胞贴壁生长后，通过外界施加干预，使弹性膜产生一定程度的形变，从而对依附于弹性膜上的细胞提供机械牵张刺激。